實習日誌 Day 8

今天主要在講解endotoxin & 實際操作怎麼去測定這個東西

Endotoxin就是lipopolysaccaride,也就是gram-negative 細菌的最外膜抗原,最常見的菌就是E.coli
也因此這個東西能當作細菌汙染程度的指標,在臨床試劑、輸送血液/洗腎液、細胞治療液...等跟臨床相關的物品上都會測
當然這不代表所有的微生物,只是一個指標;有過多endotoxin的第一症狀則是發燒,因此也可以看成endotoxin是容易引起免疫反應的抗原們



首先是實驗的器具們:

中間那一盒就是今天要用到的kit,裡面有無菌水、endotoxin標準品(From e.coli)、96孔盤'、無菌玻璃試管以及tip們,旁邊兩管tube裝的是待測物-自來水與飲用水

首先我們要稀釋樣本,並且製作我們的standard curve;在進行這些步驟前都要先vortex均勻混合,尤其是endotoxin:

取出待測樣本稀釋,今天的裝扮有點不太一樣,因為不用進到潔淨區,穿前罩式的即可:

如果是血液樣本,在處理好樣本後要加熱70度C 30分鐘,去除抗凝血劑(金屬離子螯合劑),以免影響偵測;或者是大量稀釋(200X up)
之後要把這些樣品混勻,加100 lambda到96孔盤中;比較特別的是要做positive control,要混合90 lambda的樣本與10 lambda的endotoxin:

混好後放入預熱到37度的機器中10分鐘,讓sample們準備準備!
與此同時加入適量的水到呈色基質中,並且讓他們避光! 就和elisa一樣~
再把呈色基質100 lambda加到每個孔中,同時放入機器去量30分鐘左右的亮度變化,結果如下:

超級像elisa!
數值的話如下,EU是endotoxin的單位:

Endotoxin標準曲線 R=0.998

飲用水/自來水 EU

上表的前兩大項是自來水,後兩大項是飲用水,從Result這排可以看到前者數值比較高=比較多endotoxin,大致上一般的RO水要小於2 EU/mL,所以這邊的飲用水都還滿乾淨的(1.13/1.17);自來水就比較慘了(9.49/8.29)

整體來說,這個實驗只是要代表臨床實驗一個很重要的概念:檢測驗證,要如何證明妳的最終產品乾淨呢? 妳需要有一定的標準與辦法來測驗,並且要證明這個測驗是有效且準確的!試驗再多若無法證明試驗有意義也沒用,endotoxin的試驗就是一個很好的例子

順帶一提,這樣的試劑是鱟血提煉出來的!! 可是相當相當的貴呢!!!
目前鱟分布在美國東北岸海灣與東南亞/大陸沿岸海域,一公升的血可以賣到幾十萬呢!
當然目前也有替代的測試方案,這又是另外一回事了~


晚上去看BBS鄉民的正義,夠宅的話其實裡面滿多笑點XD
有空再來分享!